PCR基因扩增实验室建设

    PCR基因扩增实验室介绍和标准：

    PCR实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。

    PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行.

PCR设计规范 /PRINCIPLES

配置原则	室全PCR线实验(高档实验室)	标准PCR实验室（中档实验室）	普通实验室（普通实验室）	测序实验室（专科实验室）
开展项目	涵盖了目前分子生物学能开展所有项目，达到国内甚至国际一流CR实验室水平。	检测项目齐全，涵盖了目前临床需求的常规检测项目，达到国内PCR标准实验室的检测水平。	临床科室或小型医院开展PCR项目，检测项目满足临床需求，达到或达不到国内PCR标准实验室的标准。	开展测序的所有检测项目，达到标准PCR实验室水平
项目先进性	除开展常规的检测项目外，还需开展高端项目，如测序项目、超敏PCR项目、肿瘤检测等高端项目。	开展项目技术性能基本满足临床需求，达到国内PCR标准实验室的检测水平。	开展项目技术性只能满足科室或小型医院的当前需求，不具有先进性。	国内外最先进的PCR测序检测项目，达到个体化诊疗的需求。
人员要求	至少有两人，除经过普通PCR上岗培训外，要具有测序项目检测实验及结果分析能力。	至少有两人，除经过普通PCR上岗培训外，要具有测序项目检测实验及结果分析能力。	至少有两人，除经过普通PCR上岗培训外，要具有测序项目检测实验及结果分析能力。	至少有两人，除经过普通PCR上岗培训外，要具有测序项目检测实验及结果分析能力。

PCR基因扩增实验室技术参数：

区域	压力	温度	相对湿度	照明
PCR走廊	+5-0Pa	20-26度	40-60%RH	主实验室≥300LX，其余房间20-300LX
PCR试剂准备区	+10Pa
PCR样品制备区	+15Pa
PCR扩增及扩增产物分析区	-15-250Pa

基因扩增检验实验室平面布局
 1）临床基因扩增检验实验室区域设置原则

1、 试剂储存和准备区  

2、 标本制备区

3、 扩增反应混合物配制和扩增区

4、 扩增产物分析区（如使用全自动分析仪，区域可适当合并。）

  2） 各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
  3） 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区 —>标本制备区—>扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。
 4） 不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

PCR扩增检验实验室原则上分为三个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增和扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增和扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

(1)试剂贮存和准备区
该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区应对外界保持微正压。

　(2)标本制备区
该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

(3-4)扩增和扩增产物分析区
　　该区域主要进行的操作为DNA扩增和扩增片段的测定。此外，已制备的DNA模板(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

   PCR区完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。

(5)缓冲区与冲洗区
整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。

可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。外面有用于实验后消毒，消毒区域有专用清洗液和专用洁净洗手池，以及消毒纸巾。

若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。
    各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。

PCR实验室建设

1、主体结构：
主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。
 2、 标准的三区分隔和气压调节：
将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增、分析三个（或）四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。
可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

3、 消毒：
在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。
4、 机械连锁不锈钢传递窗：
试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。
5、 地面
地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少800mm×800mm）接缝需要小于2mm。

6、 照明
灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。

PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。
一、分散形式PCR实验室
    所谓分散形式PCR实验室，是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验室，由于各个实验之间不易相互干扰，因此无需特殊条件要求。

二、组合形式PCR实验室
    所谓组合形式PCR实验室, 是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置，组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室，由于各个实验间集中布置，容易造成相互干扰，因此，对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入，造成污染；核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品。
如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。
    若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。
    各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。  
实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求.。

PCR实验室各区域管理规定：

试剂准备区工作制度  
 一、实验人员进入该区须更换工作服，穿本区专用绿色工作服， 戴帽子、口罩及更换专用拖鞋。 
二、实验员在试剂准备区接收标本、准备实验用的试剂。
 三、实验员每天收齐标本，验收登记后，将标本通过传递 窗送入标本制备区。  四、在试剂准备区配置好试剂后放入冰箱内备用。需要时 通过传递窗送入标本制备区。 
五、每天的标本及配置的试剂须登记记录，应书写工整详 细，使用本区专用的、带有本室标识的记录本、纸和笔。
 六、将本区废弃物装入本室垃圾袋中，有专人将垃圾带出 实验室交医院集中处理。
 七、实验后须使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭实验台 面，紫外灯消毒30分钟，记录紫外灯、冰箱、离心机等仪器的使用情况。

标本制备区工作制度   
 一、实验人员进入该区须更换工作服，穿上本区专用蓝色工作服， 戴帽子、口罩及更换专用拖鞋。
 二、把已准备好的试剂放入冰箱试剂存放专区暂存。
 三、记录温湿度计读数、冰箱的温度。
 四、严格按照SOP文件及试剂盒要求进行实验操作，加样好的PCR 管须通过传递窗送入扩增及产物区。
 五、使用本区专用的移液器及吸头，使用过的离心管、吸头须置于 盛有含氯消毒液的废液缸中，实验完毕后及时处理。将本区废弃物装入本室垃圾袋中，有专人将垃圾带出实验室交医院集中处理。
 六、使用本区专用的带有本区标识的记录本、纸和笔，其他区的用 品不得带入本区。 
七、实验完毕关闭所有仪器，记录仪器使用时间和运行状态。
 八、实验后须使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭实验台 面，紫外灯消毒30分钟，记录紫外灯、冰箱、离心机等仪器的使用情况。     

扩增及产物分析区工作制度  
  一、实验人员进入该区须更换工作服，穿上本区专用粉红色 工作服，戴帽子、口罩及更换专用拖鞋。
 二、记录温湿度计读数、冰箱的温度。
 三、本区主要进行目的基因的扩增及分析，须熟悉各扩增仪 的使用，扩增分析完后，记录结果。
 四、得到当天室内质控结果后，及时记录在室内质控图上并 进行分析。
 五、试验完毕后关掉扩增仪，记录仪器使用时间和运行状态。
 六、每周由实验室负责人对进行清洁维护并记录。
 七、扩增分析完后的反应管，须装入本室垃圾袋中，有专人 将垃圾带出实验室交医院集中处理。 
八、使用本区专用的带有本区标识的记录本、纸和笔，其他区的用 品不得带入本区。
 九、实验后须使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭实验台面，紫外灯消毒30分钟，记录紫外灯、冰箱、离心机等仪器的使用情况。

PCR实验室在操作时应注意事项

PCR（基因扩增实验室）检测微量感染因子时，操作人员容易因为污染而导致各种问题。进行PCR操作时，操作人员一定要严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染事故的发生。 

一、PCR实验室划分操作区： 

  目前，对于普通PCR，业内还无法做到单人单管和实现完全封闭管理操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的物理区域内进行，PCR的前处理和后处理一定要设计在不同的隔离区内进行： 

1、标本处理区，包括：  扩增摸板制备;

2、PCR扩增区，包括：  反应液的配制和PCR基因扩增;

3、产物分析区，包括：凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆制备。  

各工作区要具有一定的隔离，操作器材要专用，而且要有一定方向性，如，标本制备→PCR扩增→产物分析→④产物处理。切记：产物分析区的产物及器材严禁拿到前后两个工作区，避免交叉污染。 

二、PCR实验室试剂分装要求： 

  PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的负压工作台或超净工作台进行配制和分装，所有的吸头和加样器都需固定放于其中，吸头不能用来吸取扩增后的DNA和其它来源DNA：  

 1、PCR用水应为高压的双蒸水;

 2、引物和d-NTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;

 3、引物和d-NTP应分装储存，分装时应标明分装时间，以备发生污染时及时查找原因和追溯污染源头;

  三、PCR扩增重要标准

 1、PCR实验灵敏度

  PCR实验灵敏度：是指PCR扩增反应能够检测到目的基因的最小值。研究结果表明，影响PCR扩增效率的因素，有模板的完整性、反应温度、复杂程度、引物纯度及其与模板结合效率、DNA聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成(主要指： 阳离子)、反应优化剂等，这些因素都显著影响

PCR实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下，常规PCR反应能够检测到pg(10～12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因，模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此，选择什么样的PCR反应体系(包括DNA聚合酶与反应缓冲液等)就是研究者提高PCR实验灵敏度的关键因素了。  

2、PCR实验特异性

  PCR实验特异性：是指在PCR扩增过程中，专一性扩增目的片段而非其他

片段的性能。 

    在PCR实验本身的灵敏度很高，且实验条件未充分优化的情况下，通常会在目的片段出现同时伴随有其它杂带，即发生非特异性扩增现象。模板、引物性质及质量、反应条件控制等均会影响PCR扩增特异性。近年来的研究结果表明，缓冲液品质(如反应优化剂、离子种类与组成等)对保证PCR特异性扩增起着重要作用。  

 3、PCR灵敏性和特异性关联

  PCR实验灵敏度与特异性是一对此长彼消特性，这也决定我们实验体系调节实际上就是需要找到适合实验灵敏度与特异性的平衡点。由于PCR体系中的成分众多，使得组合较多，筛选工作也就相对繁杂。四、PCR实验操作注意事项：  

  尽管PCR扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应导致的，但样品间的交叉污染也是常见原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应时要谨慎对待，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应谨慎操作，一般需做到以下几点： 

 1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，应立即更换手套;

 2、避免反应液飞溅，若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

 3、使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免空气中气溶胶的污染;

4、操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后再分装，这样既可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精确度； 

5、最后加入反应模板，加入后盖紧反应管;

6、操作时设立空白对照和阴阳性对照，既可验证PCR反应的可靠性，又可

 以协助判断扩增系统的可信性;

7、由于实际操作时加样器很容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，所以操作者最好使用高压处理过的或可替换的加样器。 假如没有这种特殊的加样器，至少在PCR操作过程中加样器应该专用，严禁交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个相邻区域使用;

8、重复实验，验证结果，慎下结论。 

五、综述： 

  由于PCR实验操作非常专业，在设计PCR基因扩增实验室时设计师也要充分考虑上述技术要求，避免PCR实验室在后续使用时出现返工、返修问题。